定量PCR可以實時檢測PCR的全過程，為了準確定量和計算，取PCR反應的前半段指數擴增期數據。因為檢測的是熒光信號，首先需設定一個域值(threshold)作為熒光本底信號(baseline)。從擴增曲線上可以看到，在初始的若干個循環，由于熒光信號變化弱而一直在本底基線附近波動。當檢測到的熒光信號超過域值，就被認為是真正的信號，它可用于定義樣本的域值循環數(Ct)——PCR擴增過程中熒光信號開始由本底進入指數增長階段的拐點所對應的循環次數。實驗操作中，Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數。
顯然，CT值取決于域值。域值的量化定義是基線范圍內熒光信號強度標準偏差的10倍。實驗操作中，域值范圍定義是從第3個循環起到CT值前3個循環止，其終點要根據每次實驗的具體數據調整(前2個循環熒光信號太弱，扣除背景后的校正信號往往波動比較大；而在CT值前3個循環大多數情況下熒光信號已經開始增強，超過了基線高度)。從圖1的重復實驗中可以直觀地看到，隨著PCR反應過程，熒光信號從基線經一個轉折點進入指數期、線性期和終的平臺期，盡管平臺期DNA拷貝數波動很大，CT值卻是相對固定的。如果用不同濃度模版DNA作PCR，可以看出模版濃度越高，CT值越小。模版濃度每增加1倍，CT值減小1個循環。CT值與模板DNA的起始拷貝數成反比。這一結論可以從數學上嚴格證明。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
模板定量可分為相對定量和定量。定量指的是用已知量的標準品作標準曲線來推算未知的樣本的量。質粒DNA常作為定量標準品的制備之用。標準品的量可根據260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量來轉換成其拷貝數來確定。相對定量指的是在樣本中目標序列相對于另一參照樣本的量的變化。即參照物是1*的樣本，其它的樣本為參照物量的n倍。可以通過標準曲線法或者比較CT法進行相對定量，前者和定量相似，后者運用了數學公式來計算相對量，前提是假設每個循環增加一倍的產物數量，在PCR反應的指數期得到CT值來反應起始模板的量，一個循環（CT=1）的不同相當于起始模板數2倍的差異。但是此方法是以靶基因和內參照的擴增效率基本一致為前提的，效率的偏移將影響實際拷貝數的估計。
無論定量還是相對定量，在得到實驗結果后，還要考慮數據之間的可比性問題。在實驗操作中，取樣都是以體積或重量為單位的，但是同樣體積或重量的樣本所來源的細胞數目并不一樣，所以拷貝/μL或拷貝/ng的定量數據相互之間實際上并不可比。只有將這些數據歸一到以拷貝/細胞或拷貝/基因組為單位后，才可進行嚴格意義上的比較。這種校正可以通過適當的參比來完成。參比一般選用b-actin、GAPDH、rRNA基因等管家基因。由于它們在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數是恒定的，受環境因素影響較小，其定量結果代表了樣本中所含細胞或基因組的數量。為了減少誤差，目標基因和參比基因好在同一反應管內同時進行定量測定，所以這種對照稱為陽性內對照(InternalPositiveControl，IPC)。要進行IPC歸一化校正，
定量PCR儀必須具備多色檢測能力，好是4色。否則，目標基因和參比基因只能分兩管作定量，就不成其為“內”標了。
定量實驗與定性實驗大的不同，是要考慮統計學要求并對數據進行嚴格的校正，以消除偶然誤差。因此重復實驗和設立各種對照非常重要。這一點在實踐中往往被輕視或忽視。定量實驗，誤差是不可避免的。設立重復實驗，對數據進行統計處理，可以將誤差降低到小。所以定量實驗的每個樣本至少要重復3次以上，嚴格的定量更應當重復6～8次，以滿足小樣本統計的要求。如果作定量，則標準曲線需要在5個點以上。標準曲線使用的標準品是濃度已知的DNA樣本，雖然可以自己制備，為標準化以及發表文章起見好購買商品化的標準品。標準曲線的反應條件應當與樣本*一致，以便準確定量。
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