定量PCR可以實(shí)時(shí)檢測PCR的全過程，為了準(zhǔn)確定量和計(jì)算，取PCR反應(yīng)的前半段指數(shù)擴(kuò)增期數(shù)據(jù)。因?yàn)闄z測的是熒光信號，首先需設(shè)定一個(gè)域值(threshold)作為熒光本底信號(baseline)。從擴(kuò)增曲線上可以看到，在初始的若干個(gè)循環(huán)，由于熒光信號變化弱而一直在本底基線附近波動(dòng)。當(dāng)檢測到的熒光信號超過域值，就被認(rèn)為是真正的信號，它可用于定義樣本的域值循環(huán)數(shù)(Ct)——PCR擴(kuò)增過程中熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點(diǎn)所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。實(shí)驗(yàn)操作中，Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
顯然，CT值取決于域值。域值的量化定義是基線范圍內(nèi)熒光信號強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。實(shí)驗(yàn)操作中，域值范圍定義是從第3個(gè)循環(huán)起到CT值前3個(gè)循環(huán)止，其終點(diǎn)要根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)的具體數(shù)據(jù)調(diào)整(前2個(gè)循環(huán)熒光信號太弱，扣除背景后的校正信號往往波動(dòng)比較大；而在CT值前3個(gè)循環(huán)大多數(shù)情況下熒光信號已經(jīng)開始增強(qiáng)，超過了基線高度)。從圖1的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中可以直觀地看到，隨著PCR反應(yīng)過程，熒光信號從基線經(jīng)一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)進(jìn)入指數(shù)期、線性期和終的平臺(tái)期，盡管平臺(tái)期DNA拷貝數(shù)波動(dòng)很大，CT值卻是相對固定的。如果用不同濃度模版DNA作PCR，可以看出模版濃度越高，CT值越小。模版濃度每增加1倍，CT值減小1個(gè)循環(huán)。CT值與模板DNA的起始拷貝數(shù)成反比。這一結(jié)論可以從數(shù)學(xué)上嚴(yán)格證明。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)?！ ?/div>
模板定量可分為相對定量和定量。定量指的是用已知量的標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線來推算未知的樣本的量。質(zhì)粒DNA常作為定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備之用。標(biāo)準(zhǔn)品的量可根據(jù)260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量來轉(zhuǎn)換成其拷貝數(shù)來確定。相對定量指的是在樣本中目標(biāo)序列相對于另一參照樣本的量的變化。即參照物是1*的樣本，其它的樣本為參照物量的n倍?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)曲線法或者比較CT法進(jìn)行相對定量，前者和定量相似，后者運(yùn)用了數(shù)學(xué)公式來計(jì)算相對量，前提是假設(shè)每個(gè)循環(huán)增加一倍的產(chǎn)物數(shù)量，在PCR反應(yīng)的指數(shù)期得到CT值來反應(yīng)起始模板的量，一個(gè)循環(huán)（CT=1）的不同相當(dāng)于起始模板數(shù)2倍的差異。但是此方法是以靶基因和內(nèi)參照的擴(kuò)增效率基本一致為前提的，效率的偏移將影響實(shí)際拷貝數(shù)的估計(jì)。
無論定量還是相對定量，在得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，還要考慮數(shù)據(jù)之間的可比性問題。在實(shí)驗(yàn)操作中，取樣都是以體積或重量為單位的，但是同樣體積或重量的樣本所來源的細(xì)胞數(shù)目并不一樣，所以拷貝/μL或拷貝/ng的定量數(shù)據(jù)相互之間實(shí)際上并不可比。只有將這些數(shù)據(jù)歸一到以拷貝/細(xì)胞或拷貝/基因組為單位后，才可進(jìn)行嚴(yán)格意義上的比較。這種校正可以通過適當(dāng)?shù)膮⒈葋硗瓿?。參比一般選用b-actin、GAPDH、rRNA基因等管家基因。由于它們在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)是恒定的，受環(huán)境因素影響較小，其定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組的數(shù)量。為了減少誤差，目標(biāo)基因和參比基因好在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)進(jìn)行定量測定，所以這種對照稱為陽性內(nèi)對照(InternalPositiveControl，IPC)。要進(jìn)行IPC歸一化校正，
定量PCR儀必須具備多色檢測能力，好是4色。否則，目標(biāo)基因和參比基因只能分兩管作定量，就不成其為“內(nèi)”標(biāo)了。
定量實(shí)驗(yàn)與定性實(shí)驗(yàn)大的不同，是要考慮統(tǒng)計(jì)學(xué)要求并對數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的校正，以消除偶然誤差。因此重復(fù)實(shí)驗(yàn)和設(shè)立各種對照非常重要。這一點(diǎn)在實(shí)踐中往往被輕視或忽視。定量實(shí)驗(yàn)，誤差是不可避免的。設(shè)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，可以將誤差降低到小。所以定量實(shí)驗(yàn)的每個(gè)樣本至少要重復(fù)3次以上，嚴(yán)格的定量更應(yīng)當(dāng)重復(fù)6～8次，以滿足小樣本統(tǒng)計(jì)的要求。如果作定量，則標(biāo)準(zhǔn)曲線需要在5個(gè)點(diǎn)以上。標(biāo)準(zhǔn)曲線使用的標(biāo)準(zhǔn)品是濃度已知的DNA樣本，雖然可以自己制備，為標(biāo)準(zhǔn)化以及發(fā)表文章起見好購買商品化的標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)曲線的反應(yīng)條件應(yīng)當(dāng)與樣本*一致，以便準(zhǔn)確定量。
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