BD流式細胞儀細胞周期/DNA分析方法

 

0.01M的PBS配制方法：800ml蒸餾水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；調節(jié)pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH調節(jié)，各地蒸餾水的酸堿度不同），加蒸餾水定容至1L，0.22um濾膜過濾后，室溫保存。

 

二、制備一個陰性對照來

 

    設定流式細胞儀的取樣參數(shù)和十字門的范圍：沒有染色的細胞（制備過程如下1-6）

 

三、若做DNA倍體分析，需另設附加對照

 

    管腫瘤細胞和外周血單核細胞的混合管，比例至少為2：1

 

四、BD流式細胞儀細胞周期/DNA分析實驗步驟

 

1、將細胞消化后，用冷PBS洗細胞兩次，300g×5min（若細胞數(shù)過少可提高轉速到500g），為減少細胞損失可用1.5ml離心管離心；

2、棄上清留大約50ul下面的液體防止碰到細胞團，加入1mlBufferSolution并低速混勻細胞。

3、室溫離心，300g×5min；

4、重復2、3一次；

5、棄上清留大約50ul下面的液體，加入1mlBufferSolution重懸細胞；

6、計數(shù)細胞，用BufferSolution將細胞密度調為1×106個/ml；

7、染色：

A．取0.5ml含細胞5×105個；

B．每管加入250ulSolutionA，用手輕拍混勻（勿用漩渦混勻）；

C．室溫反應10min，保留SolutionA；

D．加入200ulSolutionB，輕輕混勻；

E．室溫反應10min，保留SolutionA+B；

F．加入200ul冷SolutionC，輕輕混勻，黑暗處2-8℃孵育10min；

用50um尼龍網過濾細胞，加入上樣管上流式分析（3h內分析完）。