PCR儀產(chǎn)生非特異性條帶、彌散條帶原因

一、產(chǎn)生非特異性條帶

1、用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的PCR結(jié)果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品；

2、在PCR反應(yīng)中，非特異的起始擴增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進(jìn)行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生；

3、由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。

二、產(chǎn)生彌散（smear）條帶

1、在PCR反應(yīng)體系中*鏈產(chǎn)物的含量過高；

2、減少引物的用量；

3、優(yōu)化PCR反應(yīng)條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù)；

4、在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會產(chǎn)生非特異性擴增，一般會顯示為彌散背景。

三、產(chǎn)生大分子量的彌散條帶

1、大多數(shù)情況下是由于退火溫度過低而導(dǎo)致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的；

2、對于長片段的PCR，建議將反應(yīng)體系中cDNA的濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200）。