熒光定量PCR儀的擴增曲線和溶解曲線講解

　　在進行熒光定量PCR儀的實驗時，不同組織樣本的RNA提取適用不同的提取方法，因為熒光定量PCR儀對RNA樣品的質(zhì)量要求較高，所以，正式實驗前要選擇一款適合自己樣品的提取方法，在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。
　　有關(guān)熒光定量PCR儀的擴增曲線和溶解曲線：
　　溶解曲線全部為單峰表明為特異性擴增。一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期，其形狀是一條平滑的S型曲線。
　　如果在熒光背景信號階段出現(xiàn)很多拐點，可能的原因是體系未混勻或者存在固態(tài)雜質(zhì)；
　　如果向下探頭后又很快抬頭然后又向下探頭，可能原因是體系中模板量太高，建議模板稀釋后再用。
　　如果引物二聚體存在則陰性對照會出現(xiàn)抬頭現(xiàn)象，這在熒光定量PCR儀中很難避免；
　　若是陰性對照的溶解曲線出現(xiàn)和樣品中同樣的峰，說明體系配置中存在污染，則實驗結(jié)果不可用。
　　在溶解曲線中出現(xiàn)雙峰有三種可能：
　　1.引物峰，引物峰通常是兩峰中的前面一個，消除的辦法是降低體系中的引物量或重新設(shè)計引物；
　　2.在做基因表達差異時容易出現(xiàn)DNA被擴增峰（只在引物跨內(nèi)含子時存在），出現(xiàn)原因是提取RNA時存在DNA污染，可以通過電泳驗證，這時要重新消化RNA樣品中的DNA；
　　3.擴增非特異，這時要重新摸擴增條件或重新設(shè)計并驗證引物。