熒光定量PCR儀的實驗心得、技巧分享

　　熒光定量PCR儀試驗中，質粒作為標準分子為何要線性化呢？
　　因為要檢測的目的基因如果不出意外的話，應該是線性的吧，而用來定標準曲線的目的基因確是連接在環狀的質粒上的。單從變性和復性的難易上就會有很大的區別，當然會對引物的結合等各方面造成影響，且環狀的空間構象和線性的空間構象上的差異。
　　做標準曲線時的基本原則之一就是要盡量的模仿需要定量的基因所在的自然條件，所以說，如果做標準曲線時可以有條件做到用和你要檢測的基因一樣的標準品做標準曲線的話，就不要選擇把一段基因克隆到質粒上。但是一般情況下是很難做到的。
　　熒光定量PCR儀的熒光定量本來就是很容易受到很多因素影響的實驗，當然是要求嚴格，當然如果檢測的基因本身就是環狀的，那當然不用線性化了。線性化比較麻煩：首先要酶切，保證*酶切，才能全部線性化。
　　然后要回收，質粒酶切后再回收容易被破壞，而且回收率也不是很高。線性化的質粒不容易保存，相對于環狀質粒來說。所以，如果有實驗證據證明不線性化的質?？梢杂?，那就可以省去很多事情。
　　熒光定量PCR儀的擴增曲線本底不斷升高是什么原因？
　　1、試劑質量差是主要原因；
　　2、模板不純是另一個重要原因；
　　3、如果模板稀釋后基線還有一定的上升，結果分析時可以避開初始的幾個上升厲害的循環；建議選用質量可靠的試劑。