熒光定量PCR儀的部分技術問題解析

　　1.熒光定量PCR儀擴增產物在電泳分析時沒有條帶或條帶很淺
　　·常見的原因在于反應體系是PCR的反應體系而不是RT-PCR的反應體系；
　　·與反應起始時RNA的總量及純度有關；
　　·建議在試驗中加入對照RNA；
　　·*鏈的反應產物在進行PCR擴增時，在總的反應體系中的含量不要超過1/10；
　　·目的mRNA中含有強的轉錄中止位點，可以試用以下方法解決：
　　①將*鏈的反應溫度提高至50℃。
　　②使用隨機六聚體代替dT進行*鏈反應。
　　2.產生非特異性條帶
　　·用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的熒光定量PCR儀測試結果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品；
　　·在PCR反應中，非特異的起始擴增將導致產生非特異性結果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結果的產生；
　　·由于mRNA剪切方式的不同，根據選擇引物的不同將導致產生不同的RT-PCR結果。
　　3.產生彌散條帶
　　·在PCR反應體系中*鏈產物的含量過高；
　　·減少引物的用量；
　　·優化PCR反應條件/減少PCR的循環次數；
　　·在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時，其產生的寡核苷酸片段會產生非特異性擴增，一般會顯示為彌散背景。
　　4.產生大分子量的彌散條帶
　　·大多數情況下是由于退火溫度過低而導致的非特異性的起始及延伸產生的；
　　·對于長片段的PCR，建議將反應體系中cDNA的濃度稀釋至1:10。