熒光定量PCR儀相關(guān)對照問題的處理

　　1.陰性對照和陽性對照都出現(xiàn)陽性擴增帶

　　原因：

　　①陰性樣品和PCR反應(yīng)試驗污染。

　　②電泳上樣時避免PCR產(chǎn)物漂移到其他孔而影響結(jié)果判定。

　　解決方法：

　　①更換全部試劑，必要時更換所有移液器。

　　②應(yīng)小心操作，或瓊脂糖凝膠加厚，增加每孔的容量，可避免加樣液的溢出。

　　2.陽性對照呈陰性

　　原因：

　　①陽性樣品或加入陽性模板失效。無論是組織還是血清，凍融1次后病原數(shù)量明顯減少。

　　②加入試劑量不準確或遺忘了某一成分。

　　解決方法：

　　①將陽性對照樣品分成小包裝。每個包裝夠用1次好。

　　②仔細核對試驗記錄，校對移液器。

　　3.出現(xiàn)非特異擴增帶

　　原因：

　　①樣品模板量過多。

　　②引物或TaqDNA聚合酶多。

　　③鎂離子濃度過高或退火溫度過低。

　　解決方法：

　　依據(jù)熒光定量PCR儀具體實驗的情況，分析上述可能出現(xiàn)的原因，采取相應(yīng)的措施。

　　4.陽性對照擴增帶弱

　　原因：

　　①電泳時瓊脂糖中EB含量少或長時間后再用已失效。

　　②擴增效率不高。

　　解決方法：

　　①是將瓊脂糖凝膠放入含有EB電泳液中再染30 min后再觀察。

　　②檢測儀器是否正常工作。

　　③增加純化DNA或cDNA樣品的稀釋倍數(shù)。