隨著發酵劑的商業 化 生 產 和 應 用 的 迅 速 增 加 ,工業發酵的基本目標自然轉向了以小的代價獲得大的產值和利潤, 而實現這一目標的工程手段是針對每個特定過程建立相應的高效發酵模式。 因此,進行工業化生產, 大規模培養非遺傳修飾菌和工程菌的技術和工藝就顯得日趨重要。 高密度培養技術( HCDC, high cell density culture) 就是滿足這一需要而發展起來的一門新興技術。 它不僅是生產高質量的濃縮型菌體和代謝產物的重要環節, 是工程菌和非工程菌能否以低成本實現規模生產的關鍵性因素, 也是菌體和代謝產物工業化生產過程中必需達到的重要目標與方向。
1.高密度培養概述
高密度培養沒有確切的定義, 是一個相對概念,指應用一定的培養技術和裝置提高菌體的發酵密度,使菌體密度較普通培養有顯著的提高, zui終提高特定產物的比生產率。 用以描述的單位是干細胞重量/升 ( DCW/ L) 。 廣 義 來 講 , 凡 是 細 胞 密 度 比 較 高 ,以至接近其理論值的培養均可稱為高密度培養, 一般認為其上限值為 150～ 200g ( DCW/ L) , 下限值為20～ 30g ( DCW/ L) 。實際上, 由于不同菌種 ( 或者不同菌株) 之間存在較大的差異, 所以高密度培養的上限值和其下限值也均有例外。 Riesenberg 曾從理論上計算了充滿整個發酵罐體積的zui高發酵菌體密度為 400g( DCW/ L) , 而 Markl H. 曾設想菌體充滿 3/ 4 發酵罐體積, 其余 1/ 4 體積是培養基, 按照菌體干重為濕重的 20%～ 25%計算, zui高菌體密度達到了 160～200g ( DCW/ L) 。
為了提高菌體或代謝產物的終發酵密度, 需要優化高密度培養每一步表達方式和方法。 微生物培養過程中生長慢的原因不僅與培養方式有關, 也與所用培養基、 培養體積有直接關系。 幾種細菌高密度培養的研究詳見表 1。限制細菌高密度培養的主要因素是培養過程中底 物 對 菌 體 生 長 的 影 響 , 具 體 體 現 在 限 制 性 底 物( 高濃度培養基) 的抑制作用、 不穩定性和揮發性底物/ 產物對菌體生長的影響 ( 如產物的分解作用, 二氧化碳的高溶解率以及熱量和氧氣的需求量等) 、 代謝產物或副產物的積累甚至還有培養基粘度等。首先, 微生物培養基及培養條件在高密度培養過程中占有很重要的地位。 培養基與產量系數和比生長速率之間存在直接關系, 高濃度的培養基成分對高密度培養有一定的抑制作用; 培養條件則與發酵過程中不同菌體的生理生化特性有關。 兩者都是在高密度培養過程中基本和必需的優化手段。
其次, 充足的底物是高密度培養的基礎, 培養過程中可以通過流加補料等方式補充菌體所耗費的營養物質。 其中低濃度氨水是常用的底物之一, 它不僅可以作為氮源的補給還可以調節培養液的 pH。后, 由于積累的代謝物明顯抑制了菌體的生長, 所以必須去除代謝副產物、 提高比生長速率。如過量的碳源導致了代謝物的積累 ( Escherichia. coli的代謝副產物是乙酸鹽, Bacillus subtilis 為丙酸鹽) ,反過來這些代謝產物的積累同時也抑制菌體對碳源
的利用?？傊? 解決菌體濃度低的方法有很多, 但必須結合工藝過程的整體特點, 考慮才能使菌體濃度達到高密度 ( 詳細論述見后) 。 培養基優化、 補料策略、 pH 值的選擇以及代謝調控都是減少代謝產物形成并使菌體以大生長率達到高密度培養的有效途徑。
1.3 高密度培養的優點
與常規培養相比, 高密度培養在發酵過程中有明顯優勢。 它可以提高菌體的發酵密度或單位體積培養液中菌體的濃度, 進而提高體積產率; 可以縮小生物反應器體積, 減少生產設備投資; 強化下游分離提取, 并在一定程度上減少廢水量; 綜合提高比生產率, 加速產品的商品化進程, 降低生產成本,并提高產品在市場上的競爭力。
 2.高密度培養的實現方法
用于細胞高密度培養的生物反應器類型有常用的攪拌罐和帶有外置式或內置式細胞持留裝置的反應器, 如透析膜反應器、 氣升式反應器、 氣旋式反應器與振動陶瓷瓶等。 高密度培養的途徑主要有透析培養、 細胞循環培養、 補料分批培養等, 其中,后者是較為成熟和完善的技術。
2.1優化培養基
在分批培養過程中, 當培養體系中的營養成分( 包括碳源、 氮源和無機鹽等) 的濃度超過某一臨界值時, 微生物會為抵抗高鹽濃度、 維持胞內環境而形成離子梯度。 這一過程需耗能才能完成, 其結果會明顯抑制菌體生長, 降低菌體得率。 這就是分批培養過程中直接把含有營養物質的培養基加入, 而增加的濃度不能獲得高菌體密度的原因, 也是高密度培養往往采用分批補料培養的原因。 因此, 選擇適當的營養物質和適當濃度的營養物質是達到菌體高密度的重要途徑之一。在實際培養過程中, 可以根據產生菌的特性和產品需求有效地控制基質培養基的品種和用量, 進行深入分析以獲得適合菌體生長繁殖的增殖培養基。
以桿菌肽為例：培養基中初始葡萄糖耗盡后，控制葡萄糖的流加速率，使培養基中的葡萄糖濃度維持在一個穩定的濃度，使菌體比生長速率維持一定的速率， 較好的平衡菌體的初級代謝與次級代謝，可避免乙酸等副產物的大量積累， 又能滿足菌體桿菌肽合成的需求。當維持葡萄糖濃度過低時，無法維持較高的生物量， 桿菌肽的合成速率低， 影響終的產量。當維持葡萄糖濃度過高時， 菌體生長旺盛、 初級代謝過強，菌體會發生“葡萄糖” 效應抑制菌體生長， 抑制次級代謝產物合成。因此維持發酵過程中合適的葡萄糖濃度可有效地減少副產物的累積， 提高桿菌肽合成效率。發酵基礎料中初始葡萄糖濃度為 10g /L，當發酵液中葡萄糖濃度下降到一定濃度時，通過流加 40% 葡萄糖溶液，維持發酵液中葡萄糖的濃度為 1g /L、 2g /L、 3g /L 和 5g /L，結果使菌體的初級代謝與次級代謝達到理想平衡， 使桿菌肽發酵達到理想效果，30h 放罐效價達到 1015u /ml。
  
2.2 控制培養條件
適溫度
適溫度隨著菌種、 培養基成分、 培養條件和菌體生長階段變化而改變。 不同的微生物適生長溫度范圍存在一定的差異。 溫度的變化一方面影響各種酶反應的速率和蛋白質的性質, 另一方面影響發酵液的物理性質。 在實際發酵過程中發酵液釋放出大量的熱量, 所以一般情況下實驗所用的發酵罐都不需要加熱, 相反需要冷卻的情況多一些。 冷卻的方法有兩種, 一是通過冷卻水熱交換來降溫, 也可以采用冷凍鹽水進行循環式降溫, 保持恒溫發酵。
1. pH 值
在高密度培養過程中, pH 值的變化是菌體產酸或產堿等生化代謝反應的綜合結果, 也是確定補料速率的依據, 把兩者緊密結合起來可以實現高密度培養發酵過程的優化。 在響應曲面法 pH- stat 流加高密度培養模式中, 就是通過不斷補料的方法, 成功調節 pH 使菌體達到了高密度。
2. 溶氧濃度 ( DO)
在高密度培養中, 溶氧濃度的高低對菌體生長、產物的合成以及產物的性質都會產生不同的影響 。隨著菌體密度的增加, 單位體積培養物的攝氧率增加, 使發酵罐內溶氧水平逐漸下降, 低于臨界氧濃度時就會抑制菌體生長。 為了增加發酵液的溶氧量,需要增大攪拌轉速和增加空氣流量。然而, 在大規模發酵過程中, 使用純氧容易導致微生物氧中毒。 Meyer 和 Fiechter [16] 曾報道, 需氧發酵并不是溶氧越高越好。 適當的溶氧水平有利于菌體生長和產物合成, 但是溶氧太高有時會抑制產物的形成。 因此, 為了正確控制溶解氧濃度, 有必要考察每一種發酵產物的臨界溶氧濃度和適溶氧濃度, 并使發酵過程保持在適溶氧濃度。 可以通過控制菌的比生長速率, 使溶氧濃度保持在比臨界值略高一點的水平, 達到這一目的。
3. 氧化還原電位
氧化還原電位對專性厭氧微生物的生存有明顯的影響, 過高時會導致菌體立即死亡。 分子氧對專性厭氧微生物的毒害作用是由于提高了環境的氧化還原電位。 環境中存在的還原性物質, 如抗壞血酸、H2S 和含巰基的有機物等, 可以使環境保持較低的氧化還原電位, 這時即使有分子氧存在, 專性厭氧微生物也不會死亡。
4.代謝產物的調控
代謝產物的調控是研究高密度培養的一種重要手段。 依據對生長曲線的分析, 培養中導致微生物生長停止的主要原因之一是代謝產物的積累和反饋抑制作用。 高密度培養過程中, 細胞在電子傳遞鏈和三羧酸循環代謝中都會產生乙酸及其它代謝產物。當分批培養中的細胞密度超過一定濃度時, 菌體會緩慢甚至停止生長。 這是由于發酵過程中乙酸鹽等鹽類對細菌的生長產生了負面影響, 抑制了蛋白質合成的代謝副產物的積累。 目前國外已有研究希望通過代謝工程改變細菌的代謝途徑, 從而降低乙酸等其它代謝物的生成。
3.結論
隨著市場需求的日益擴大, 高密度培養技術廣泛地應用于各種微生物 ( 乳酸菌、 芽孢桿菌、 大腸桿菌等) 的生產中, 它不僅可以改進發酵工藝, 提升其現代化發酵進程, 而且對于增加單位體積培養液中菌體數量, 提高生產率, 加速微生物制劑的商品化進程, 更好地滿足市場需求, 具有重要而深遠的意義。