熒光定量PCR儀分析PCR擴增各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR因為產物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。
　　PCR擴增出現非特異性擴增帶：
　　熒光定量PCR儀的PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：
　　引物與靶序列不*互補、或引物聚合形成二聚體；
　　Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關；
　　酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。
　　對策：必要時重新設計引物；減低酶量或調換另一來源的酶；降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數；適當提高退火溫度或采用二溫度點法。
　　PCR擴增出現片狀拖帶或涂抹帶：
　　PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶；減少dNTP的濃度；適當降低Mg2+濃度；增加模板量，減少循環次數。